lunes, 29 de agosto de 2016
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra mediante una reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc.
Cada ciclo de la PCR se lleva a
cabo en tres etapas principales: desnaturalización,
hibridación y extensión:
Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de
ADN son calentadas y separadas a una temperatura de
95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de
la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de
G-C es alta, será necesario más tiempo para romper
sus uniones debido a que el apareamiento de estas
bases está formado por tres enlaces, uno más que las
bases de A-T. Además, depende de la velocidad en
la que el termociclador aumenta la temperatura, esto
varía de acuerdo al modelo del equipo. Al final de esta
etapa tendremos las cadenas separadas que servirán
como templado para el siguiente paso.
Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.
Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.
Mitos y Realidades:
http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.
Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.
Mitos y Realidades:
http://www.microbial-systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
Extracción de DNA
Extracción de Ácido Desoxirribonucleico (DNA):
La extracción de DNA consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir en la PCR.
Etapas en la extracción de DNA
Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del DNA mediante un proce- dimiento químico son:
-
Lisis de las células o virus. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las
proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un
detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas.
-
Degradación de la fracción proteica asociada al DNA. Se consigue mediante la adición
de una proteasa. La fracción proteica puede
precipitarse mejor con la ayuda de sales
como el acetato de amonio o el acetato
sódico.
- Purificación. Consta de 3 fases. Precipitación del DNA. El DNA es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol i recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente.
Célula Eucariota Animal
La célula eucariota animal presenta las siguientes estructuras:
1. Membrana plasmática
2. Citoplasma
3. Núcleo
4. Orgánulos:
− Sin membrana
- Ribosomas: Pequeños orgánulos celulares, constituidos por ARN y proteínas encargados de la síntesis de proteínas.
- Citoesqueleto: Conjunto de filamentos proteicos que forman redes complejas. Mantienen la forma celular e intervienen en el movimiento de orgánulos y división celular.
- Centriolos: Cilindros formados por túbulos que dirigen el movimiento de cilios y flagelos y participan en el reparto del material genético durante la división celular.
Célula Eucariota
Célula eucariota:
La célula eucariota se caracteriza por la presencia de un núcleo en cuyo interior se encuentra el material genético. Las células eucariotas son mayores que las procariotas; tienen un tamaño que oscila entre las 10 y las 100 µm.
A pesar de que existen dos tipos de células eucariotas (animal y vegetal) tienen en común las siguientes estructuras:
- Membrana plasmática: Es una envoltura o capa formada principalmente por lípidos y proteínas. Delimita la célula, le da forma y permite el intercambio de sustancias con el medio externo.
- Citoplasma: Es el espacio comprendido entre la membrana plasmática y el núcleo. Está formado por una sustancia líquida y viscosa en la que se encuentran inmersos los orgánulos, es decir, los diversos componentes de la célula encargados de diferentes funciones.
- Núcleo: Se encuentra en el interior de la célula, posee una doble membrana en cuyo interior se encuentra el material genético.
La célula eucariota se caracteriza por la presencia de un núcleo en cuyo interior se encuentra el material genético. Las células eucariotas son mayores que las procariotas; tienen un tamaño que oscila entre las 10 y las 100 µm.
A pesar de que existen dos tipos de células eucariotas (animal y vegetal) tienen en común las siguientes estructuras:
- Membrana plasmática: Es una envoltura o capa formada principalmente por lípidos y proteínas. Delimita la célula, le da forma y permite el intercambio de sustancias con el medio externo.
- Citoplasma: Es el espacio comprendido entre la membrana plasmática y el núcleo. Está formado por una sustancia líquida y viscosa en la que se encuentran inmersos los orgánulos, es decir, los diversos componentes de la célula encargados de diferentes funciones.
- Núcleo: Se encuentra en el interior de la célula, posee una doble membrana en cuyo interior se encuentra el material genético.
Célula Procariota
Célula procariota
Las células procariotas se caracterizan por no
presentar núcleo. Son células de menor tamaño que las eucariotas y suelen medir
entre 1 y 10 µm. Los seres vivos más representativos de este tipo son las
bacterias.
Presentan las siguientes
estructuras:
1. Membrana
plasmática: Estructura flexible que delimita la célula y permite y regula
los intercambios con el medio exterior. Tiene unos repliegues internos, los
donde tiene lugar la mayoría de las reacciones químicas propias de la nutrición
celular.
2. Pared
bacteriana: Envoltura rígida, externa a la membrana plasmática.
3. Citoplasma:
Espacio que ocupa el interior de la célula, constituido por una sustancia
líquida y otros componentes celulares inmersos en él.
4. Ribosomas:
Orgánulos encargados de la síntesis de proteínas. Son los únicos orgánulos
presentes en las células procariotas.
5. Material
genético: Cadena de ADN que flota libremente en el citoplasma.
6. Flagelo:
Lo presenta algunos grupos de bacterias. Los flagelos son estructuras
filamentosas que salen al exterior desde la membrana plasmática y permiten el
movimiento de la célula.
La forma de las células bacterianas es muy
diversa, algunas de ellas son:
− Bacilos: Forma de
bastón
− Cocos: Forma
esférica
− Espirilos: Forma de
tirabuzón
− Vibrios: Forma de coma.
Estructura celular
Todas las células presentan una estructura común
formada por: membrana plasmática, citoplasma y material genético.
Existen dos tipos de estructura celular:
• Célula procariota
• Célula eucariota
−
Animal
−Vegetal
¿Que es Biología Celular y Molecular?
La Biología Molecular es una
ramificación de la ciencia referente a actividad biológica en el nivel
molecular.
La biología es la ciencia dedicada al estudio de la composición, el desarrollo,
las relaciones y el funcionamiento de los organismos vivos. Molecular, por su parte, es aquello
vinculado a las moléculas: las
unidades mínimas de un elemento que mantienen sus propiedades químicas y que
pueden estar compuestas por átomos diferentes o idénticos Estas ideas nos
permiten adentrarnos en la definición de biología molecular. Se trata de la rama de la biología que está centrada en el análisis de los fenómenos biológicos a
partir de la perspectiva de la estructura
de las moléculas.
Puede decirse que la biología
molecular estudia, desde el punto de vista molecular, los procesos que llevan a
cabo los organismos con vida. A través de los conocimientos sobre las propiedades de las moléculas, es
posible explicar diversas cuestiones de la vida.
Por lo general la biología
molecular se orienta a las macromoléculas:
las moléculas de mayor tamaño y peso molecular. En este marco adquieren
particular importancia las proteínas
y los ácidos nucleicos, dos
macromoléculas de enorme relevancia en el funcionamiento de los organismos.
Los expertos en biología
molecular estudian la composición, la estructura y las funciones de las
moléculas que son vitales en el desarrollo de los procesos vitales. La síntesis
de proteínas, los vínculos entre el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) y el metabolismo son algunas de
las temáticas de interés de los biólogos moleculares, que muchas veces trabajan
en conjunto con especialistas en genética,
química, citología y otras áreas
del conocimiento.
Concepto
http://definicion.de/biologiamolecular/#ixzz4OL0WQzmU
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