Laboratorio Virtual

http://www.hhmi.org/biointeractive/explore-virtual-labs

Prsentación: Preparación de gel de poliacrilamida hasta el Western Blot.

Presentación Determinación de peso molecular de proteinas (Electroforesis)

Vídeo y Presentación SDS-PAGE (Sodium Duodecylsulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Electrophoresis en gel de Poliacrilamida

Electrophoresis de proteinas en gel de poliacrilamida

La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comunmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna una de las técnicas más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.

Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas..

Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica.

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/page.htm#Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida

Información de Purificación de proteína en Vídeo

Purificación de Proteínas

Métodos cromatográficos para separación de proteínas.

Las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias de carga, tamaño o afinidad de las diferentes proteínas. Uno de los métodos más habitualmente utilizados para la separación de proteínas es la cromatografía en columna, aunque también existe la cromatografía en papel y en placa.
La columna está rellena con un material sólido con las características químicas adecuadas (fase estacionaria), y una solución tamponada se hace pasar a través de la columna (fase móvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria.
Generalmente estas cromatografías se realizan de una forma semiautomática, la fase móvil se hace pasar a la columna a través de una bomba peristáltica y un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto número de gotas o de volumen. Después hay que localizar en que tubo o tubos está la proteína que se pretende purificar.

Existen distintos tipos de cromatografías algunos de ellos son: 

Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular. La fase estacionaria esta constituida por partículas de polímeros de diferente porosidad. La separación se basa en el tamaño de las partículas. Las proteínas más grandes que no pueden penetrar en los poros de las partículas de la matriz de filtración son eluidas con más rapidez que las proteínas más pequeñas que penetran por los poros de las partículas y siguen un camino más tortuoso y más largo. El tamaño de los poros internos depende de la naturaleza del polímero en cuestión, y permite la entrada a proteínas por debajo de un determinado peso molecular.

Cromatografía de intercambio iónico: En ella, la columna está rellena con un soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aniónico) o negativamente (intercambio catiónico). Estos grupos cargados normalmente están neutralizados por iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las proteínas con más tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos dependiendo de su carga neta. Las proteínas más
cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La afinidad con la que una proteína se une a un intercambiador iónico depende de la fuerza iónica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína y los iones de la fase móvil.
Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase móvil (aumentando la concentración de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas.

Cromatografía hidrofóbica: Se trata de un método similar al anterior con la única diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se pega al soporte por los resto de aminoácidos apolares, cuanto más residuos de este tipo tenga en su superficie, más apolar será, más se retendrá en la columna y se eluirá más tarde. En este caso a elusión se realiza aumentando la apolaridad de fase móvil.

Cromatografía de afinidad: Muchas proteínas tienen la capacidad de unirse específicamente a ciertas moléculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de proteínas se aplica a la columna, la proteína buscada se unirá al ligando inmovilizado mientras que las demás saldrán de la columna con el tampón. En este caso también se utiliza el incremento de fuerza iónica para eluir las proteínas. 

Vídeo de los pasos para realizar transformación bacteriana